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Evaluación de la toxicidad

A continuación, se detallan las oportunidades para eliminar o reducir significativamente el uso de animales en la evaluación de la toxicidad de sustancias en el contexto de los requisitos regulatorios en esta materia. También se describen las áreas en las que se requiere un mayor apoyo para desarrollar métodos innovadores que sean relevantes para la evaluación de la salud humana y los parámetros ambientales.

En caso de que las pruebas sean requeridas con fines regulatorios, deben consultarse fuentes directas, como los sitios web de la Organización para la Cooperación y el Desarrollo Económicos (OCDE), el Consejo Internacional para la Armonización de Requisitos Técnicos para Productos Farmacéuticos de Uso Humano (ICH) y la Agencia de Protección Ambiental de EE. UU. (EPA), para obtener las versiones más recientes de las directrices y guías correspondientes.

Enfoques para la evaluación de la toxicidad

La toma de decisiones regulatorias se facilita mediante el uso de toda la información relevante disponible sobre una sustancia. Una forma de evaluar toda la evidencia es utilizar un enfoque integrado de pruebas y evaluación (IATA)1 que considere múltiples tipos de información sobre la toxicidad de una sustancia a partir del peso de la evidencia (WoE). La información que debe tenerse en cuenta incluye datos existentes sobre la sustancia (por ejemplo, de estudios in chemico, in vitro, in vivo en humanos o in vivo en animales), las propiedades fisicoquímicas de la sustancia, datos de enfoques sin pruebas (por ejemplo, QSAR y read-across), datos recientemente generados (de preferencia, mediante métodos confiables y relevantes sin animales), tecnologías ómicas (por ejemplo, toxicogenómica) y patrones de uso o escenarios de exposición. Los datos considerados más confiables, relevantes y/o útiles para el ámbito regulatorio tienen mayor influencia en la conclusión de la evaluación. Al evaluar los datos disponibles en conjunto, es posible realizar una evaluación robusta del riesgo de una sustancia sin generar nuevos datos mediante estudios adicionales in vivo (véase, por ejemplo, la sección sobre carcinogenicidad). Además, una evaluación holística de los datos garantizará que no se dupliquen estudios in vivo existentes.

Las evaluaciones mediante IATA y WoE suelen requerir juicio experto al momento de integrar los resultados de enfoques combinados para llegar a una conclusión fundamentada para la toma de decisiones. Los métodos, tecnologías y marcos que pueden incluirse en dichos enfoques son accesibles para quienes cuentan con el conocimiento tecnológico adecuado y existen diversos documentos de orientación y estudios de caso que ayudan a desarrollar un IATA. Por ejemplo, la OCDE ha publicado directrices sobre el uso de enfoques definidos dentro de un IATA.2 Los enfoques definidos consisten en un procedimiento fijo de interpretación de datos (por ejemplo, un modelo matemático o un enfoque basado en reglas) aplicado a datos generados con un conjunto definido de fuentes de información para derivar una predicción sin necesidad de juicio experto.3 En la sección de sensibilización cutánea verás ejemplos de enfoques definidos.

Las rutas de resultados adversos (AOP) ofrecen un marco adicional para organizar los datos recopilados mediante diversos métodos y niveles biológicos y evaluar las conexiones entre eventos clave y efectos adversos. A diferencia de las pruebas en animales, los métodos sin animales reflejan la biología y los mecanismos de toxicidad relevantes para los humanos. Las AOP organizan eventos clave vinculados causalmente desde la exposición química hasta un resultado adverso. Las pruebas sin animales que evalúan eventos clave específicos en una AOP permiten establecer si ocurrirá un resultado adverso tras la exposición química en humanos. El Programa de Desarrollo de AOP de la OCDE respalda el diseño estructurado de las AOP y proporciona orientación para su uso dentro de un IATA, tal como se describe en su Documento de Orientación para el Uso de Rutas de Resultados Adversos en el Desarrollo de Enfoques Integrados de Pruebas y Evaluación. Esta iniciativa promueve la aplicación práctica de las AOP en entornos regulatorios.4

Como se mencionó anteriormente, la consideración de la exposición también puede formar parte de un enfoque integrado. Cuando la exposición humana y ambiental a una sustancia es baja o cuando las propiedades fisicoquímicas de una sustancia determinan que ciertas vías de exposición no son relevantes, podría no estar científicamente justificado (o ser posible) realizar pruebas de toxicidad para cumplir con ciertos requisitos de información. Cuando se considera la exposición, el enfoque de la toma de decisiones regulatorias puede pasar de un método basado en el peligro a un enfoque centrado en el riesgo que permita minimizar las pruebas en animales.5

Sin embargo, se necesita un marco sistemático para evaluar la relevancia biológica y toxicológica de los métodos individuales, considerando también diferentes escenarios de exposición. A fin de consolidar estos enfoques, la Cooperación Internacional en Regulación de Cosméticos (ICCR) ha establecido principios clave para integrar métodos sin animales en una estrategia de evaluación de riesgos de próxima generación (NGRA),6 un enfoque basado en la exposición y guiado por hipótesis, que integra métodos sin animales para garantizar que la exposición a sustancias químicas no cause daño.7 La Asociación para la Evaluación de Riesgos de Sustancias Químicas (PARC), una iniciativa financiada por la UE para modernizar las evaluaciones de seguridad química, también tiene como objetivo que la NGRA sea el enfoque predeterminado para la evaluación de riesgos químicos en la legislación europea sobre sustancias químicas.8

Además de minimizar las pruebas en animales, los IATA pueden aprovechar datos y usar métodos de alto rendimiento para evaluar un gran número de sustancias químicas de manera más eficiente que las pruebas en animales. Los IATA tienen el potencial de transformar dramáticamente el panorama regulatorio actual al permitir decisiones más relevantes para los humanos y basadas en la evaluación del peligro y de la exposición. Asimismo, con un esfuerzo concertado entre las partes interesadas, se pueden lograr avances similares con enfoques integrados para la protección ambiental.9

Cosméticos

En Australia, Brasil, Canadá, Colombia, Corea del Sur, Ecuador, Guatemala, India, Suiza, Taiwán, el Reino Unido y la UE, entre otras regiones, se ha promulgado legislación que prohíbe las pruebas en animales con fines cosméticos y/o la venta de productos cosméticos que contengan ingredientes probados en animales. En otros países, como EE. UU., se han adoptado leyes que limitan el uso de datos de pruebas en animales a nivel estatal en lugar de a nivel nacional. Este cambio global hacia la eliminación de las pruebas en animales para cosméticos muestra que este sector ha estado a la vanguardia en métodos innovadores de evaluación de seguridad que tienen el potencial de aplicarse de manera más amplia.

Sin embargo, a pesar del carácter innovador de estas prohibiciones, ciertos requisitos regulatorios han socavado su plena implementación. Por ejemplo, las empresas pueden vender productos en la UE y el Reino Unido, incluso si han sido probados en animales en otros lugares, como China, siempre que los resultados de esas pruebas no se usen para cumplir los requisitos de las normativas cosméticas correspondientes. Las empresas pueden pagar por pruebas en animales exigidas en otros mercados mientras usan datos de métodos sin animales para cumplir con las normativas de la UE o del Reino Unido. En EE. UU., aunque no existe un requisito específico para probar productos cosméticos o sus ingredientes en animales, debido a los diferentes enfoques regionales para la clasificación de productos, la FDA solicita en algunos casos dichas pruebas después de que los productos han sido aprobados para su comercialización.10 Los protectores solares, por ejemplo, se regulan como cosméticos en la UE, pero en EE. UU. son considerados medicamentos de venta libre. La FDA ha anunciado su intención de exigir que se realicen nuevas pruebas en animales para mantener en el mercado los protectores solares que contengan cualquiera de los 12 ingredientes activos específicos indicados en una orden de 2021. No se ha hecho ninguna solicitud similar de nuevos datos sobre los mismos productos en la UE ni en otros lugares.

También existen conflictos en algunas áreas entre la legislación sobre productos químicos industriales y la legislación específica para cosméticos. La Agencia Europea de Sustancias y Mezclas Químicas (ECHA), respaldada por la Comisión Europea, puede exigir pruebas en animales en virtud del reglamento REACH (Registro, Evaluación, Autorización y Restricción de Sustancias Químicas) para evaluar la exposición de los trabajadores y los riesgos ambientales de las sustancias usadas exclusivamente en productos cosméticos. Para la evaluación de sustancias utilizadas en cosméticos y en otros tipos de productos, los requisitos regulatorios de REACH se aplican a todos los parámetros de salud humana y ambiental, independientemente de la exposición de los trabajadores.11 Conflictos legislativos similares también existen en Australia y Canadá.

Dado que actualmente se usan diversos métodos sin animales para la evaluación de cosméticos, es posible eliminar las pruebas en animales y, al mismo tiempo, promover el rigor científico. Por ejemplo, la NGRA es un enfoque progresivo que implica una evaluación basada en hipótesis y guiada por la exposición, combinando métodos in silico, in chemico e in vitro para permitir predicciones de riesgo más precisas y garantizar la confiabilidad de las evaluaciones de seguridad.12131415 Los marcos NGRA pueden adaptarse para tomar decisiones sobre la seguridad de los trabajadores expuestos a productos químicos durante la fabricación.16 Del mismo modo, los estudios de caso de la OCDE demuestran cómo los enfoques escalonados y flexibles de pruebas y evaluación pueden usarse para abordar problemas de seguridad en diferentes escenarios regulatorios, desde la sensibilización cutánea hasta la toxicidad sistémica y reproductiva.17 La guía del Comité Científico de Seguridad de los Consumidores (SCCS) sobre evaluaciones de seguridad cosmética ofrece información sobre cómo aplicar eficazmente estos enfoques innovadores.18 Además, la Colaboración Internacional en la Seguridad de los Cosméticos (ICCS), una coalición de empresas de cosméticos y cuidado personal, fabricantes de ingredientes, asociaciones comerciales y ONG,19 está desarrollando directrices estandarizadas de buenas prácticas sobre el uso y la comprensión de las nuevas metodologías y las NGRA para avanzar en su aceptación regulatoria.20

La falta de alineación entre las políticas y los avances científicos en la evaluación de cosméticos subraya la necesidad urgente de tomar medidas eficaces para garantizar que se usen métodos sin animales para proteger a los consumidores, los trabajadores y el ambiente. En mayo de 2023, el gobierno del Reino Unido dio un paso significativo al suspender la emisión de nuevas licencias para pruebas en animales de ingredientes usados exclusivamente en cosméticos.21 Para noviembre de 2023, el Ministerio del Interior confirmó que dichas pruebas también habían cesado bajo todas las licencias antiguas que aún estaban vigentes.22 Esta medida marca el avance del Reino Unido hacia la eliminación total de las pruebas en animales para cosméticos. Sin embargo, los ingredientes que también se usan en otros productos para el hogar continúan sometiéndose a pruebas en animales, ya que no están completamente exentos de este requisito.

La transparencia total es esencial para promover decisiones informadas por parte de los consumidores, garantizar la confianza del público y abordar la pérdida de efectividad de la legislación y las políticas diseñadas para asegurar que no se usen animales en la evaluación de productos cosméticos ni de sus ingredientes para ningún fin regulatorio.

Ecotoxicidad

Toxicidad acuática y bioacumulación

Las pruebas de toxicidad acuática se realizan para medir los efectos de los productos químicos en el ambiente y los animales silvestres. En 2022, más de 122 mil peces fueron usados con fines regulatorios en la UE y Noruega.23 Dado que la evaluación de la bioacumulación y la toxicidad acuática es un requisito en diversos marcos normativos, se necesitan con urgencia estrategias para sustituir las pruebas en animales acuáticos.

Se ha desarrollado un prometedor ensayo de citotoxicidad con la línea celular RTgill-W1 para estas evaluaciones,24 y la correspondiente directriz de prueba de la OCDE fue adoptada en 2021.25 Este ensayo in vitro puede reducir o incluso reemplazar el uso de animales en la prueba de toxicidad aguda en peces.26

Para mejorar la predicción de la toxicidad aguda en peces, el proyecto 2.54 del plan de trabajo del Programa de Directrices de Prueba de la OCDE está elaborando un documento de orientación sobre IATA para esta área. Este proyecto está copresidido por Austria y el Consejo Internacional para la Protección Animal en los Programas de la OCDE (ICAPO), representado por PETA Science Consortium International.

Aunque todavía se requiere la experimentación en animales, el número usado y la necesidad de repetir estudios pueden reducirse mediante la aplicación cuidadosa del Documento de Orientación 23 de la OCDE sobre Pruebas de Toxicidad Acuática de Sustancias y Mezclas Difíciles.27 Este documento se actualizó en 2019 con información sobre enfoques para las pruebas de toxicidad acuática de productos químicos difíciles de evaluar. En esta guía se prestó especial atención a la actualización de los métodos disponibles para evaluar sustancias químicas poco solubles en agua, evitando el uso de disolventes. De este modo, se elimina la necesidad de un grupo de control con disolvente y se reduce el número de animales usados en las pruebas. Además, EE. UU. e ICAPO (representado por PETA Science Consortium International) codirigen el proyecto 2.55 del plan de trabajo del Programa de Directrices de Ensayo de la OCDE sobre el uso y análisis de peces de control en estudios de toxicidad. En este proyecto, se emplean análisis estadísticos de datos existentes y simulaciones para investigar si es posible realizar estudios de toxicidad acuática con un solo control cuando se usa un disolvente, reduciendo aún más el número de animales explotados para este fin.

Actualmente existen varios métodos sin animales para reducir el número de peces usados en pruebas de bioacumulación. En 2018, la OCDE adoptó dos ensayos para la evaluación de la depuración intrínseca in vitro con hepatocitos de trucha arcoíris criopreservado28 y la fracción subcelular S9 del hígado de trucha arcoíris29 así como su documento de orientación correspondiente.30 Los valores de depuración intrínseca hepática pueden emplearse en modelos toxicocinéticos basados en la fisiología para la bioacumulación en peces y para la extrapolación a una tasa de biotransformación in vivo. Esta última puede usarse con modelos in silico para la predicción de factores de bioconcentración. Así, aunque estas directrices de ensayo requieren el uso de peces para obtener células primarias, pueden contribuir a sustituir el uso de peces vivos en la Prueba N.º 305 de la OCDE sobre bioacumulación en peces.31

Toxicidad en aves

En la actualidad, la mayoría de las autoridades regulatorias exigen pruebas de toxicidad en aves para evaluar los posibles efectos ecológicos de las sustancias químicas en aves terrestres. Generalmente se requieren tres de estas pruebas para cumplir con los requisitos regulatorios: pruebas orales agudas, pruebas alimenticias y pruebas de reproducción. En las pruebas orales agudas y alimenticias se usan hasta 120 aves. En la prueba oral, se les administra la sustancia de manera forzada mediante una sonda durante un día, seguida de un período de observación de 14 días. En la prueba alimenticia, se les da la sustancia química como alimento durante cinco días, seguida de un período de observación de tres días. En la prueba de reproducción, más de 120 aves adultas son alimentadas con la sustancia química durante ocho a diez semanas y se asesinan varios cientos o miles de crías para examinar posibles efectos adversos en la reproducción.

La comunidad científica ha expresado su preocupación sobre la utilidad de las pruebas en aves para proteger a las especies terrestres. Los resultados de estas pruebas, que a menudo se realizan en dos especies, se usan para extrapolar los posibles efectos en miles de especies de aves regionales. Además, la evitación del alimento, la regurgitación y otros problemas causados por los métodos empleados para dosificar a las aves han dado lugar a estimaciones de toxicidad inexactas.

Para abordar estos problemas, PETA Science Consortium International colaboró con la EPA para evaluar el uso de pruebas orales y alimenticias en aves en la toma de decisiones sobre la gestión de riesgos.32 La revisión retrospectiva examinó 20 años de datos de evaluación de riesgos y encontró que la prueba alimenticia generalmente no se usa para la gestión de riesgos. Este estudio se utilizó para respaldar la política de la EPA de 2020 (Guía final para la exención de pruebas alimenticias subagudas en aves para el registro de pesticidas y análisis retrospectivo de apoyo) que puede evitar que más de 700 aves sean sometidas a pruebas de toxicidad cada año y ahorrar recursos que se emplearían mejor en el desarrollo de métodos sin animales adecuados para pruebas de toxicidad terrestre.33

PETA Science Consortium International está llevando a cabo una iniciativa similar para examinar el uso de dos especies en pruebas de reproducción aviar. Esta revisión retrospectiva analizará las diferencias en la sensibilidad de las especies de aves frente a cientos de ingredientes activos en pesticidas, con el fin de identificar tendencias sobre cómo se usan las respuestas de toxicidad en la toma de decisiones regulatorias. La iniciativa busca identificar información que no se está utilizando en este proceso. Además de estos proyectos, iniciativas como Sequence Alignment to Predict Across Species Susceptibility (SeqAPASS) buscan modernizar las pruebas ecológicas mediante métodos computacionales predictivos que tienen el potencial de reducir las pruebas en animales terrestres y mejorar la protección ecológica.34

La falta de armonización a nivel global resulta en un aumento de las pruebas para cumplir con requisitos regionales específicos. Por ejemplo, la Comisión Europea y el Comité Central de Insecticidas y Registro (CIB&RC) en la India exigen el uso de una sola especie para la prueba de reproducción aviar, mientras que la EPA en EE. UU. y la Agencia Reguladora de Manejo de Plagas de Canadá requieren dos especies de prueba. Además, la EPA permite exenciones para la prueba alimenticia aviar, y dicha prueba no es requerida por la Comisión Europea ni en Japón, pero sigue siendo obligatoria en India y China. La armonización es necesaria para eliminar a nivel mundial la exigencia de pruebas que, como se ha demostrado, no aportan información útil o que están afectando la calidad de la toma de decisiones regulatorias.

Disrupción endocrina

Los alteradores endocrinos (o disruptores endocrinos) son sustancias químicas naturales o sintéticas que interfieren con el sistema endocrino35 e influyen en diversas respuestas de las vías biológicas responsables de regular funciones biológicas fundamentales, como el crecimiento, el desarrollo, la reproducción, el equilibrio energético, el metabolismo o la regulación del peso corporal. Desde la perspectiva regulatoria de la seguridad química, las vías endocrinas más investigadas son los sistemas de estrógenos, andrógenos, tiroides y esteroidogénesis (EATS) y, en menor medida, los sistemas no EATS, como la vía de los retinoides.36

Se sabe mucho sobre los complejos mecanismos mediante los cuales las sustancias químicas pueden interferir con las vías endocrinas en humanos37 y animales silvestres.38 Numerosas AOP  relacionadas con la disrupción endocrina están incluidas en el AOP Wiki,39 y la OCDE ha publicado varios estudios de caso sobre IATAs.40 Las pruebas in vivo para evaluar la disrupción endocrina presentan una alta variabilidad (por ejemplo, el estrés que experimenta un animal puede influir significativamente en el resultado del estudio) y baja sensibilidad, por lo que es poco probable que detecten eventos relevantes de disrupción endocrina.41 Los estudios clásicos basados en parámetros finales no son apropiados en esta área y deben ser reemplazados por estudios in vitro, en los cuales los múltiples factores que podrían afectar los resultados pueden controlarse de manera más eficaz.

Entre 2019 y 2024, ocho proyectos bajo el European Cluster to Improve Identification of Endocrine Disruptors (EURION), con una financiación de 50 millones de euros por parte de la Comisión Europea, se centraron en el desarrollo de herramientas destinadas a mejorar la evaluación regulatoria de los efectos relacionados con el sistema endocrino (alteración del sistema de hormonas tiroideas, trastornos metabólicos, neurotoxicidad del desarrollo y fertilidad femenina) y en reducir la dependencia de las pruebas en animales. Un reporte sobre el proyecto EURION concluyó que se necesita apoyo para una implementación más rápida de los hallazgos científicos en métodos de prueba, así como para la actualización de los requisitos de prueba en las normativas químicas con el fin de incluir los ensayos desarrollados recientemente.42

La Oficina de Investigación y Desarrollo (ORD) de la EPA está desarrollando ensayos in silico e in vitro, así como AOP, para evaluar de manera robusta los efectos de sustancias químicas sobre el sistema endocrino. Por ejemplo, el Toxicity Forecaster (ToxCast) de la EPA clasifica y prioriza sustancias químicas usando más de 700 ensayos de cribado de alto rendimiento y toxicología computacional que abarcan una variedad de respuestas celulares relevantes y vías de señalización.

Tras un estudio comparativo de los resultados de los ensayos de la vía del estrógeno en ToxCast y en el ensayo uterotrófico,43 la EPA anunció que aceptará los datos del Modelo de Bioactividad ER de ToxCast como alternativa a al menos una prueba en animales,4445 el ensayo uterotrófico, que evalúa los efectos sobre la vía del estrógeno.46 En la UE, el Modelo de Bioactividad ER de ToxCast se acepta actualmente como fuente de información in vitro sobre el mecanismo de acción. Esta información es requerida como parte de la identificación de sustancias como disruptores endocrinos en el marco regulatorio vigente para biocidas y productos fitosanitarios.

En colaboración con otras organizaciones, el Centro Común de Investigación de la UE y la EPA ORD están desarrollando conjuntos de ensayos relevantes basados en el AOP de la tiroides y evaluando su validez.47 En 2024, la OCDE incorporó a su plan de trabajo para el desarrollo de directrices dos de estos ensayos dirigidos a diferentes eventos moleculares desencadenantes de la disrupción de la vía tiroidea.

Irritación/corrosión ocular

Para evaluar la irritación y la corrosión ocular mediante la prueba de Draize, se aplica una sustancia química en los ojos de los conejos y se monitorea el grado de daño durante 14 días. Los conejos pueden sufrir inflamación ocular, secreción, ulceración, hemorragias, opacidad o ceguera. La prueba de Draize se desarrolló en 1944 y, desde entonces, se han creado métodos de reemplazo avanzados que han demostrado ser igual de o más confiables que la prueba en conejos. Por ejemplo, un análisis de 491 sustancias químicas con al menos dos pruebas oculares en conejos mostró que la probabilidad de obtener la misma clasificación del Sistema Globalmente Armonizado de Clasificación y Etiquetado de Productos Químicos (GHS) más de una vez fue del 73% para la categoría GHS 1 (causa daño ocular grave), 32,9% para la categoría GHS 2A (irritante), 15,5% para la categoría GHS 2B (irritante leve) y 93,9% para ninguna categoría (no irritante).48 Es importante destacar que estos resultados mostraron que existía una probabilidad del 10,4% de que una sustancia identificada inicialmente como causante de daño irreversible grave (categoría 1) fuera clasificada después como no irritante (sin categoría).

Existen métodos robustos sin animales que pueden reemplazar completamente la prueba de Draize sin necesidad de juicio experto ni de una evaluación basada en el WoE:

  • Prueba de la OCDE Nro. 492B: Ensayo con epitelio humano reconstruido similar a la córnea (RhCE) para la identificación de peligros oculares. Puede usarse para identificar sustancias químicas que no requieren clasificación (GHS sin categoría) y aquellas que requieren clasificación por irritación ocular (categoría 2 del GHS) y por daño ocular grave (categoría 1 del GHS).
  • Prueba de la OCDE Nro. 467: Enfoques definidos para daño ocular grave e irritación ocular. Los enfoques de esta prueba se basan en:
    • Propiedades fisicoquímicas y datos in vitro de la Prueba de la OCDE Nro. 492 (ensayo con epitelio humano reconstruido similar a la córnea, RhCE) y la Prueba de la OCDE Nro. 437 (método de opacidad y permeabilidad corneal bovina, BCOP) para líquidos puros no tensioactivos.
    • Datos in vitro de la Prueba de la OCDE Nro. 491 (ensayo in vitro de exposición corta, STE) y la Prueba de la OCDE Nro. 437 para líquidos puros y/o diluidos no tensioactivos o sólidos disueltos en agua.
    • Datos in vitro de la Prueba de la OCDE Nro. 437 y la Prueba de la OCDE Nro. 492 para sólidos puros.

Los enfoques definidos pueden usarse para identificar sustancias químicas que no requieren clasificación (GHS sin categoría) y aquellas que requieren clasificación por irritación ocular (categoría 2 del GHS) y por daño ocular grave (categoría 1 del GHS).

Como se describe en la guía de la OCDE sobre un IATA de daño ocular grave e irritación,49 otros métodos in vitro pueden combinarse para reemplazar completamente la prueba de Draize:

  • Prueba de la OCDE Nro. 494: Ensayo Vitrigel-Eye para irritación ocular. Puede usarse para identificar sustancias químicas que no se clasifican por irritación ocular ni daño ocular grave (GHS sin categoría).
  • Prueba de la OCDE Nro. 496: Ensayo macromolecular in vitro. Puede usarse para identificar sustancias químicas que causan daño ocular grave (categoría 1 del GHS) y/o que no requieren clasificación.
  • Prueba de la OCDE Nro. 460: Ensayo de fuga de fluoresceína. Puede usarse para identificar sustancias químicas que causan daño ocular grave (categoría 1 del GHS). Se recomienda como paso inicial en un enfoque descendente (top-down) para identificar corrosivos o irritantes severos.
  • Prueba de la OCDE Nro. 438: Ensayo con ojo de pollo aislado. Puede usarse para identificar sustancias químicas que causan daño ocular grave (categoría 1 del GHS) o que no requieren clasificación. Se recomienda como primer paso dentro de una estrategia de ensayo descendente (top-down) o ascendente (bottom-up).

Estos métodos están generalmente validados para su uso con cosméticos y productos químicos industriales. Algunos métodos serán más apropiados que otros, dependiendo del dominio de aplicabilidad del método, del propósito de la prueba y del tipo de sustancia química (por ejemplo, tensioactivos o sólidos).

La EPA actualmente acepta el uso de métodos in vitro y ex vivo para determinar la irritación y la corrosión ocular al clasificar productos químicos industriales, productos de limpieza antimicrobianos y, previa evaluación, otros productos pesticidas. La Oficina de Prevención de la Contaminación y Sustancias Tóxicas de la EPA publicó en 2024 una guía que desaconseja las pruebas prospectivas de Draize para nuevos productos químicos,50 y en 2015, la Oficina de Programas de Pesticidas (OPP) publicó una guía que describe las pruebas que la industria puede usar para este parámetro.51 OPP también publicó en su página web52 un artículo –escrito por PETA Science Consortium International y NICEATM, entre otros– que propone  enfoques definidos que combinan métodos in vitro y ex vivo para evaluar el potencial de irritación y corrosión ocular de formulaciones agroquímicas.53

Genotoxicidad y carcinogenicidad

Genotoxicidad

Los principales parámetros de genotoxicidad que deben evaluarse con fines regulatorios son la mutación génica, las aberraciones cromosómicas estructurales (clastogenicidad) y las aberraciones cromosómicas numéricas (aneuploidía). Las guías de la OCDE para evaluar la genotoxicidad in vitro cubren uno o dos parámetros simultáneamente:

  • Prueba de la OCDE Nro. 471: Ensayo de mutación inversa en bacterias. Conocido como prueba de Ames, este ensayo usa Salmonella typhimurium y Escherichia coli, que requieren aminoácidos, para detectar mutaciones puntuales por sustituciones de bases o desplazamientos del marco de lectura (frameshifts).
  • Prueba de la OCDE Nro. 487: Ensayo in vitro de micronúcleos. Puede usarse para detectar micronúcleos en el citoplasma de células en interfase que han experimentado división celular durante o después de la exposición a una sustancia de prueba. Este ensayo detecta aberraciones cromosómicas estructurales y numéricas.
  • Prueba de la OCDE Nro. 490: Ensayos in vitro de mutación génica en células de mamífero usando el gen de la quinasa de la timidina. Se pueden usar dos ensayos distintos para detectar mutaciones génicas inducidas por sustancias químicas.
  • Prueba de la OCDE Nro. 473: Ensayo in vitro de aberraciones cromosómicas en células de mamífero. Este ensayo identifica sustancias químicas que causan aberraciones cromosómicas estructurales.
  • Prueba de la OCDE Nro. 476: Ensayo in vitro de mutación génica en células de mamífero usando los genes Hrpt y xrpt. Estos ensayos pueden detectar mutaciones génicas inducidas por sustancias químicas.

La evaluación de la genotoxicidad para fines regulatorios generalmente se realiza en etapas, comenzando con una batería básica de pruebas in vitro (por ejemplo, las pruebas de Ames, micronúcleos y aberraciones cromosómicas). La necesidad de complementar las pruebas in vitro con pruebas in vivo depende de los resultados y de los requisitos regulatorios. Por ejemplo, en el caso de las normativas de la UE sobre productos químicos industriales y biocidas, un resultado positivo en cualquiera de las pruebas in vitro requeridas debe ser seguido por una prueba in vivo.5455 Sin embargo, si una sustancia produce resultados negativos en las pruebas in vitro, puede clasificarse como sin potencial genotóxico y no se requerirían más pruebas de genotoxicidad. Por el contrario, para algunas clases de productos químicos, se exigen pruebas in vivo independientemente de los resultados de las pruebas in vitro (por ejemplo, productos fitosanitarios y productos farmacéuticos).5657

Se puede reducir la necesidad de realizar pruebas in vivo si se cuenta con datos apropiados provenientes de estudios in silico (por ejemplo, QSAR y read-across). Por ejemplo, la base de datos consolidada sobre genotoxicidad y carcinogenicidad de EURL ECVAM, publicada en la colección EURL ECVAM del catálogo de datos del Centro Común de Investigación (JRC), proporciona recursos sustanciales para read-across.58

Además, los métodos avanzados in vitro pueden ofrecer opciones de seguimiento y reducción de riesgos para su uso en un enfoque basado en el WoE. Por ejemplo, el biomarcador transcriptómico in vitro sensible a agentes que inducen daño en el ADN (DDI), el TGx-DDI,5960 y el ensayo ToxTracker616263 pueden proporcionar información sobre el modo de acción de posibles genotóxicos y han sido presentados en programas regulatorios formales de “calificación”.6465 Los datos generados mediante el ensayo ToxTracker y read-across se han usado en los expedientes REACH de la UE.66

Los ensayos de micronúcleos y de cometa en piel tridimensional reconstruida son métodos adicionales sin animales que pueden usarse para dar seguimiento a resultados positivos de los ensayos estándar de genotoxicidad in vitro en compuestos administrados por vía dérmica. Estos métodos representan una oportunidad importante para evitar el uso de animales en las pruebas de genotoxicidad.67 Los requisitos de información para la evaluación de genotoxicidad de cosméticos68 ya pueden incluir la prueba de micronúcleos o de cometa usando piel humana tridimensional reconstruida. Para esta última prueba también se pueden usar células de mamífero. El rápido progreso en el desarrollo de modelos tridimensionales de hígado y vías respiratorias ofrece la posibilidad de que en un futuro cercano no se usen animales en la evaluación del potencial genotóxico de compuestos administrados por vía oral o inhalatoria.69

Los métodos sin animales están ganando terreno a nivel internacional. Generar datos completos basados en estos métodos y desarrollar estudios de caso, como el de la cumarina usada en productos cosméticos, es un componente importante para respaldar la adopción de la evaluación de riesgos de próxima generación.7071

Los estudios de caso IATA sobre genotoxicidad72 y mutagenicidad73 de la OCDE74 ilustran enfoques viables para desarrollar directrices adecuadas de evaluación de la seguridad para determinar el riesgo de genotoxicidad sistémica sin pruebas en animales.

Carcinogenicidad

La evaluación de la carcinogenicidad a menudo requiere realizar pruebas en ratas y/o ratones durante la mayor parte de su vida (hasta dos años). La prueba requiere un mínimo de 400 ratas y/o ratones por cada evaluación química (Pruebas de la OCDE Nro. 451, 452 y 453).

Aunque los estudios de carcinogenicidad en animales todavía se realizan de manera rutinaria, la prueba ha estado bajo escrutinio científico desde principios de la década de 1970 por su falta de reproducibilidad75 y su incapacidad para predecir resultados en humanos.76 Cabe destacar que existen dos supuestos erróneos que subyacen a estos bioensayos: (1) los carcinógenos en roedores son carcinógenos en humanos, y (2) la exposición a dosis altas en roedores indica una dosis ambientalmente relevante. Los datos de carcinogenicidad producidos en los últimos 50 años han demostrado que ambos supuestos son incorrectos. Décadas de revisiones científicas resaltan la falta general de confiabilidad de los bioensayos de cáncer en roedores para predecir cáncer en humanos.7778798081

Por ejemplo, un programa de la UE evaluó 202 revisiones de plaguicidas y demostró que el estudio de carcinogenicidad en ratones aportó poco o nada a la determinación de una ingesta diaria aceptable para la evaluación del riesgo crónico en humanos y la clasificación de peligros con fines de etiquetado.82 En cuanto a las aprobaciones de plaguicidas, los autores mostraron que el estudio en ratones no influyó en ningún resultado. Un estudio adicional señaló que los datos recopilados de 182 sustancias farmacéuticas muestran que se obtiene poco valor del estudio de carcinogenicidad cuando los compuestos carecen de ciertos factores de riesgo histopatológicos, alteraciones hormonales y resultados positivos en pruebas de toxicidad genética.83 Este estudio se usó para respaldar un grupo internacional que desarrolló un enfoque basado en WoE para cumplir algunos de los requisitos de la prueba de carcinogenicidad sin el ensayo de dos años en ratas.8485 El trabajo de este grupo dio lugar a un apéndice de la directriz para la evaluación de carcinogenicidad de productos farmacéuticos (ICH S1B) que brinda la oportunidad de evitar el uso de 400 animales por cada evaluación regulatoria farmacéutica.86 Una iniciativa similar,  denominada Rethinking Chronic Toxicity and Carcinogenicity Assessment for Agrochemicals Project (ReCAAP) y liderada por PETA Science Consortium International, desarrolló un marco para respaldar una evaluación basada en WoE de plaguicidas sin pruebas de carcinogenicidad a largo plazo en ratas y ratones.87 El marco ReCAAP ha sido aceptado para su publicación por el Grupo de Trabajo de la OCDE para la Evaluación de Peligros (WPHA), mediante el cual ocho organismos reguladores globales respaldaron el enfoque basado en WoE para satisfacer las necesidades de evaluación de seguridad, sin realizar pruebas de por vida en ratas y ratones.88

Además, se están llevando a cabo actividades para desarrollar un marco para evaluar la carcinogenicidad de sustancias químicas no genotóxicas, incluidas las iniciativas del grupo de expertos sobre carcinógenos no genotóxicos (NGTxC) del Grupo de Trabajo para el Programa de Directrices de Ensayo (WNT) de la OCDE. Este marco ofrece un enfoque modular para evaluar e integrar datos in vitro e in silico en un estilo de AOP para determinar la bioactividad que podría conducir a la carcinogenicidad.89

La OCDE WNT también está evaluando los ensayos de transformación celular in vitro (CTA) por su capacidad para reproducir un proceso multietapa que modele algunos aspectos de la carcinogénesis in vivo. El CTA tiene el potencial de detectar tanto carcinógenos genotóxicos como no genotóxicos.90 En su recomendación sobre el CTA basado en la línea celular Bhas 42, EURL ECVAM señala que la información sobre el potencial transformador de las sustancias generada por los CTA puede ser suficiente para la toma de decisiones.91 Tras un estudio en el que el CTA Bhas 42 se probó con 98 sustancias, incluidos carcinógenos humanos conocidos, la OCDE recomendó que este ensayo se use como parte de una estrategia de pruebas para ayudar a evaluar sustancias potencialmente cancerígenas.9293 Cuando se combinan con otra información, como datos de genotoxicidad, análisis de estructura-actividad e información toxicocinética, los CTA en general, y el CTA Bhas 42 en particular, pueden contribuir a la evaluación del potencial carcinogénico y ofrecer una alternativa a las pruebas in vivo.9495

Varios modelos y herramientas computacionales ayudan además a evaluar el potencial de carcinogenicidad. Las alertas estructurales que señalan posibles carcinógenos no genotóxicos se han incorporado en la herramienta OECD QSAR Toolbox.96 Además, la EPA publicó OncoLogic™, un modelo informático para evaluar el potencial carcinogénico de sustancias químicas.97 También existen opciones comerciales, como las de Lhasa Limited, MultiCASE, UL Cheminformatics e Instem. En última instancia, la identificación de sustancias químicas reactivas con el ADN mediante la prueba de Ames o alertas estructurales genotóxicas puede combinarse con la identificación de carcinógenos no genotóxicos mediante alertas estructurales, dejando a los CTA modelar la mayor parte de lo que queda sin explicar en un enfoque basado en WoE.

Dada la complejidad de la carcinogénesis, los expertos reconocen que es necesario integrar nuevos enfoques (por ejemplo, in silico o in vitro) para respaldar una evaluación de seguridad adecuada basada en WoE.98 Por fortuna, se están llevando a cabo iniciativas para facilitar la integración de métodos y lograr, finalmente, una evaluación de carcinogenicidad sin animales, rápida y relevante para humanos en la regulación química y farmacéutica.99100101102

Fototoxicidad

Las sustancias que absorben luz en el rango UV y visible (290 a 700 nm) y que pueden llegar a la piel o a los ojos podrían requerir pruebas para determinar su potencial fototoxicidad o la respuesta tóxica a una sustancia administrada por vía tópica o sistémica que ocurre tras exponerse a la luz. La fototoxicidad puede causar síntomas que van desde quemaduras de primer grado (enrojecimiento, picazón y dolor) hasta quemaduras de tercer grado. La fototoxicidad, también llamada fotosensibilidad, es un efecto adverso bien conocido de muchos medicamentos, incluidos los antimicrobianos, antiinflamatorios no esteroideos, diuréticos y agentes quimioterapéuticos.103

Las pruebas de fototoxicidad para compuestos administrados por vía sistémica o tópica se han realizado en diversas especies, como cobayos, ratones y ratas. Sin embargo, no se ha establecido un diseño de estudio in vivo validado o estandarizado.104105 En cambio, hasta ahora se han desarrollado tres directrices de prueba de la OCDE usando métodos in chemico e in vitro para evaluar la fototoxicidad:

  • Prueba de la OCDE Nro. 495: Ensayo de especies reactivas de oxígeno (ROS) para fotorreactividad. Este método in chemico mide la capacidad de una sustancia para generar especies reactivas de oxígeno bajo exposición a la luz solar artificial.
  • Prueba de la OCDE Nro. 432: Ensayo in vitro 3T3 NRU de fototoxicidad. Esta prueba mide la viabilidad de una línea celular de ratón incubada con un potencial fototóxico y expuesta a la luz.
  • Prueba de la OCDE Nro. 498: Fototoxicidad in vitro. Método de ensayo de fototoxicidad con epidermis humana reconstruida. En esta prueba, un modelo tridimensional de epidermis humana reconstruida se incuba con el potencial fototóxico y se expone a la luz.

Esta última prueba (Nro. 498) se basa en un principio similar al de la Nro. 432, pero usa un modelo tridimensional de piel humana reconstruida en lugar de la línea celular de ratón. Esto amplía el dominio de aplicabilidad a una mayor selección de sustancias, incluidas formulaciones finales, mezclas complejas o parches dermatológicos.106 Las sustancias con un pH extremo también pueden evaluarse con modelos tridimensionales de piel.

De acuerdo con el Documento de Orientación de la OCDE sobre Enfoques Integrados para Pruebas y Evaluación (IATA) para determinar la fototoxicidad, estas directrices pueden combinarse con otras evaluaciones fisicoquímicas y métodos in vitro e in silico, sin animales, para estimar el potencial fototóxico de una sustancia.107

Pirogenicidad

Las agencias reguladoras exigen pruebas para demostrar que determinados medicamentos y dispositivos médicos no están contaminados con sustancias que desencadenan una respuesta febril. Estas sustancias, denominadas pirógenos, son química y estructuralmente diversas, pero suelen causar fiebre en humanos mediante un mecanismo común: los monocitos y macrófagos de la sangre periférica detectan los pirógenos y liberan citocinas proinflamatorias que inducen un aumento de la temperatura corporal. Existen dos métodos in vitro disponibles para detectar pirógenos:

  • Ensayo de activación de monocitos (MAT), definido en el capítulo general 2.6.30 de la Farmacopea Europea (Ph. Eur.) y permitido en el capítulo general 151 de la Farmacopea de Estados Unidos (USP).
  • Ensayo con Factor C recombinante (rFC), definido en el capítulo general 2.6.32 de la Ph. Eur. y, a partir de mayo de 2025, en el capítulo general 86 de la USP.

Aunque el mecanismo de la respuesta febril humana se conoce bien, aún es frecuente que las instancias reguladoras globales requieran dos pruebas en animales para evaluar la contaminación por pirógenos. En la prueba de pirógenos en conejos (RPT), se inyecta a los animales una sustancia de prueba y luego se les inmoviliza durante tres horas, tiempo en el que se monitorean los cambios en su temperatura corporal de forma rectal. Solo en la UE y Noruega, más de 125 mil conejos fueron usados entre 2018 y 2022 en la RPT.108 Algunos países parecen haber dejado de usar la RPT. Sin embargo, Francia y España usaron más de 6 mil animales cada uno en la RPT en 2022, a pesar de que nunca se ha validado formalmente la relevancia de esta prueba para los humanos y sus resultados pueden variar según el nivel de estrés del animal. También existen diferencias en la sensibilidad a los pirógenos entre especies y la prueba es incompatible con ciertas clases de medicamentos.109

La prueba de lisado de amebocitos de Limulus (LAL) requiere el uso de hemolinfa de cangrejos herradura capturados y solo detecta endotoxinas bacterianas, no otros pirógenos. Después del proceso de sangrado, hasta el 30% de los cangrejos muere y aquellos que se recuperan tienen menos probabilidades de sobrevivir en la naturaleza.110 Una versión sintética del LAL, en la que la hemolinfa se reemplaza por un reactivo recombinante (el ensayo rFC), está disponible para detectar endotoxinas bacterianas. El ensayo rFC es una prueba confiable y respetuosa con los animales, con un desempeño igual o superior al de la prueba LAL.111

Desde 2010, el ensayo in vitro de activación de monocitos (MAT), capaz de detectar tanto pirógenos endotóxicos como no endotóxicos, ha sido validado e incluido en la Ph. Eur.112 En el MAT, los medicamentos y dispositivos médicos se incuban con sangre humana entera o monocitos humanos aislados. Después de este período de exposición, se miden las citocinas proinflamatorias liberadas por los monocitos.113 El MAT evita los problemas mencionados anteriormente con las pruebas RPT y LAL y, como se ha documentado en estudios de caso, este ensayo ha detectado contaminación por pirógenos en productos que habían pasado las pruebas RPT y LAL pero causaron fiebre en pacientes humanos.114

Los reguladores en India, la UE, el Reino Unido y EE. UU., así como las farmacopeas usadas en estas regiones, permiten el uso del MAT y del rFC tras la validación para un producto específico. No obstante, las pruebas en animales siguen realizándose a pesar de que sus limitaciones se han documentado a profundidad.115 Para eliminar el uso de animales en las pruebas de pirógenos, las entidades regulatorias y las organizaciones de normalización deben esforzarse más para integrar y armonizar una preferencia por las pruebas sin animales en los requisitos internacionales y para alentar a los fabricantes de medicamentos y dispositivos a usar y presentar datos de estas pruebas en sus solicitudes de aprobación. En septiembre de 2018, los participantes en un taller organizado por PETA Science Consortium International y NICEATM discutieron enfoques sin animales para las pruebas de pirógenos en dispositivos médicos y solicitaron más oportunidades de capacitación y educación para aumentar el uso del MAT con fines regulatorios.116

Tras una encuesta a usuarios de pruebas de pirógenos, la Dirección Europea de Calidad de Medicamentos y Atención Sanitaria (EDQM) revisó el capítulo general de la Ph. Eur. sobre el MAT para hacerlo más accesible y enfatizar que se considera un reemplazo de las pruebas de pirógenos en animales.117118 La Agencia Europea de Medicamentos también ha aprobado el MAT,119 y la Comisión de la Ph. Eur. eliminó la RPT de la Ph. Eur. en 2025.120 La Organización Internacional de Normalización (ISO) está revisando su guía para permitir el uso del MAT para  evaluar la contaminación por pirógenos en dispositivos médicos, pero el proceso de revisión ha avanzado lentamente.121 En la octava edición de la Farmacopea India, la Comisión de la Farmacopea India revisó el capítulo general sobre pruebas de pirógenos, introdujo la monografía sobre el MAT y reemplazó la RPT por LAL.122 Sin embargo, debido a la falta de claridad y la ambigüedad regulatoria sobre la aplicabilidad del MAT como prueba independiente de pirógenos, la RPT y el LAL continúan usándose.

Toxicidad reproductiva y del desarrollo

Los estudios de toxicidad reproductiva y del desarrollo miden el efecto de una sustancia química en los órganos reproductivos y en la descendencia en desarrollo durante el embarazo.

Los estudios de toxicidad del desarrollo para la evaluación de la seguridad de productos químicos y farmacéuticos para los humanos se realizan principalmente en ratas. Sin embargo, muchos marcos regulatorios, incluidas las normativas sobre productos biocidas y fitosanitarios y, en algunas circunstancias, REACH en la UE, exigen que los solicitantes presenten resultados de pruebas en una segunda especie, generalmente conejos, bajo el supuesto de que existen diferencias entre especies en la sensibilidad a los efectos sobre el desarrollo. Estas pruebas usan un gran número de animales. Por ejemplo, un estudio estimó que el número total de animales usados para los parámetros reproductivos y de desarrollo en los expedientes de registro existentes de la base de datos pública de la ECHA (a diciembre de 2022) es aproximadamente 2,7 millones.123

Ninguno de los métodos in vivo usados para evaluar la toxicidad reproductiva y del desarrollo ha sido validado formalmente por su relevancia para los humanos,124 y las evaluaciones retrospectivas han encontrado limitaciones significativas y subjetividad en la interpretación de los datos.125126 Por lo tanto, se requiere una inversión considerable para desarrollar métodos sin animales que sean relevantes para los humanos. Recientemente, se incluyeron 42 AOP del AOP-wiki relevantes para la toxicidad reproductiva en mamíferos en una red de AOP para la toxicidad reproductiva mediada por estrógenos, andrógenos y esteroidogénesis. Estas AOPs abarcan efectos sobre niveles o actividad hormonal, cáncer, sistemas reproductivos masculino y femenino, y efectos generales sobre la fertilidad y la reproducción.127

Debido al amplio conocimiento sobre los eventos clave de la toxicidad reproductiva y del desarrollo, se han desarrollado muchos ensayos y baterías de pruebas prometedoras. El proyecto EU ReProTect, que tenía como objetivo desarrollar métodos innovadores para evaluar la toxicidad reproductiva, demostró que una batería de varias pruebas in vitro e in silico, incluida la prueba con células madre embrionarias, podía proporcionar información valiosa sobre efectos adversos durante el desarrollo embrionario.128 Un ensayo novedoso basado en biomarcadores de células madre humanas, ReproTracker®, identifica el potencial teratogénico de las sustancias químicas.129 Además, se desarrolló una batería de pruebas que incluye el ensayo de activación transcripcional CALUX (para actividad esteroidogénica), el ensayo ReProGlo (para el patrón del eje corporal y la especificación del destino celular), la prueba con células madre embrionarias (para diferenciación en cardiomiocitos) y el ensayo de embriotoxicidad en pez cebra.130

Asimismo, el proyecto EU-ToxRisk integra avances en biología celular, tecnología “ómica”, biología de sistemas y modelado computacional para definir las cadenas complejas de eventos que vinculan la exposición química con los resultados tóxicos. El proyecto se centra en la toxicidad sistémica por dosis repetidas y en la toxicidad reproductiva y del desarrollo. El Centro Nacional de Toxicología Computacional de la EPA también explora el potencial de las sustancias químicas para alterar el desarrollo prenatal mediante el uso de su modelo virtual de embrión, v-Embryo™, que integra enfoques de modelado in vitro e in silico.131 La OCDE, el JRC, la Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria (EFSA) y la EPA han desarrollado recomendaciones que demuestran que la integración de una batería de ensayos in vitro puede usarse para determinar el potencial de neurotoxicidad de las sustancias químicas en el desarrollo, y las agencias asociadas están trabajando en estudios de caso que se aplican a diferentes clases de sustancias químicas.132133134 Un estudio comparó los puntos de partida basados en bioactividad in vitro (PODBioactivity) con los puntos de partida de estudios orales de dosis repetidas, desarrollo y reproducción (PODTraditional) usados en la evaluación de riesgos. Para 43 de las 46 sustancias químicas examinadas, el PODBioactivity fue más conservador que el valor más bajo del PODTraditional, lo que indica que la bioactividad in vitro puede usarse como una estimación sustituta del límite inferior de los niveles de efectos adversos in vivo,ya que sería al menos tan protectora como usar PODTraditional.135

Si bien el campo avanza gradualmente hacia una gama de estrategias integradoras para cubrir la mayoría de los mecanismos posibles, se requiere mucha más investigación.

Irritación/corrosión cutánea

Varias agencias reguladoras requieren o recomiendan realizar pruebas de irritación y corrosión cutánea para sustancias químicas. En la prueba en animales, se aplica la sustancia a evaluar sobre la piel rasurada de un conejo y se observa durante 14 días para evaluar el grado de daño cutáneo. Las pruebas pueden causar daño permanente en la piel, úlceras, sangrado, costras y cicatrices.

Los estudios de irritación cutánea en animales se han usado durante años, a pesar de que se ha demostrado que, en general, son predictores deficientes de las reacciones cutáneas humanas y altamente variables.136 Por ejemplo, un estudio que comparó datos de pruebas en conejos y pruebas de parche cutáneo de cuatro horas en humanos para 65 sustancias encontró que el 45% de las clasificaciones del potencial irritante químico basadas en pruebas en animales eran incorrectas.137

Con base en los criterios descritos en la guía Nro. 237 de la OCDE, existen oportunidades para evitar las pruebas en animales.138 Además, la OCDE ha desarrollado un IATA para irritación cutánea con métodos in vitro que evitan o minimizan el uso de animales.139

  • Prueba de la OCDE Nro. 439: Ensayo in vitro de irritación cutánea con epidermis humana reconstruida (RHE). Esta prueba puede usarse para la identificación del peligro asociado con sustancias químicas irritantes (sustancias y mezclas) de categoría 2 o no clasificadas, de acuerdo con el GHS. Puede usarse como prueba independiente o en una estrategia escalonada.
  • Prueba de la OCDE Nro. 431: Ensayo de corrosión cutánea in vitro con RHE. Esta prueba puede usarse para identificar sustancias y mezclas químicas corrosivas, así como para distinguir entre corrosivos cutáneos graves y menos graves.
  • Prueba de la OCDE Nro. 435: Ensayo in vitro de barrera de membrana para corrosión cutánea. Esta prueba permite clasificar las sustancias químicas corrosivas en una de las tres subcategorías de corrosividad del GHS..

Recientemente, la guía de prueba Nro. 439 de la OCDE fue validada para su uso en la evaluación de la capacidad de los extractos de dispositivos médicos para causar irritación cutánea, y la guía ISO 10993 se ha actualizado para incluir esta prueba.140

Sensibilización cutánea

La evaluación de la sensibilización cutánea mide la probabilidad de que una sustancia cause una reacción alérgica si se aplica sobre la piel. La prueba en animales implica inyectarles a cobayos la sustancia a evaluar o aplicarla sobre su piel rasurada, en lo que se conoce como prueba de maximización en cobayos, o aplicarla en las orejas de ratones en el ensayo del ganglio linfático local.

El requisito regulatorio para evaluar la sensibilización cutánea puede cumplirse mediante un enfoque definido, tal como se describe en la Prueba de la OCDE Nro. 497 (enfoques definidos para la sensibilización cutánea), usando una combinación de ensayos in chemico e in vitro que abordan diferentes eventos clave en la AOP.141 El enfoque definido “2 de 3” proporciona información suficiente para la identificación del peligro, y las pruebas integradas (ITSv1 e ITSv2) recopilan información de dos de los ensayos in vitro listados a continuación y predicciones in silico del peligro y la potencia.

  • Prueba de la OCDE Nro. 442C: Ensayos de sensibilización cutánea in chemico que abordan el evento clave de la AOP sobre la unión covalente a proteínas. Esta prueba aborda el evento molecular inicial de la AOP de sensibilización cutánea.
  • Prueba de la OCDE Nro. 442D: Ensayos de sensibilización cutánea in vitro que abordan el evento clave de la AOP sobre la activación de queratinocitos. Esta prueba aborda el segundo evento clave de la AOP de sensibilización cutánea.
  • Prueba de la OCDE Nro. 442E: Ensayos de sensibilización cutánea in vitro que abordan el evento clave sobre la activación de células dendríticas. Esta prueba aborda el tercer evento clave del AOP de sensibilización cutánea.

Cuando se comparan con datos provenientes de humanos, los enfoques sin animales para predecir la sensibilización cutánea son tan buenos o mejores que el ensayo del ganglio linfático local.142

Toxicidad sistémica

Toxicidad sistémica aguda

Para determinar el peligro de la exposición a un producto o sustancia química, se administra la sustancia a animales por vía oral, dérmica o inhalatoria. La toxicidad aguda se refiere a los efectos adversos observados después de una exposición única a un nivel elevado de una sustancia durante un período corto (hasta 24 horas). En estas pruebas se determina la dosis en la que moriría la mitad de los animales, denominada dosis letal 50 (DL50) o concentración letal 50 (CL50) para pruebas por inhalación. La prueba DL50 y sus adaptaciones nunca han sido validadas científicamente y su precisión para predecir los efectos químicos en humanos sigue siendo cuestionable. Un análisis de la variabilidad de la prueba animal de toxicidad oral aguda mostró que la exactitud para obtener la misma clasificación de la EPA o del GHS, respectivamente, es del 78% o 74% cuando la misma sustancia química se prueba más de una vez.143 Otro análisis de datos existentes de DL50 oral aguda demostró que los estudios replicados resultan en la misma categorización de peligro en promedio el 60% de las veces.144 Este análisis también demostró que la variabilidad biológica o del protocolo subyacente probablemente explica la variación en los resultados.

Cuando se proporciona justificación científica, las autoridades regulatorias pueden permitir la evaluación de toxicidad aguda sin pruebas en animales. La OCDE ha publicado directrices para la exención o la integración de pruebas de toxicidad aguda145 y la EPA ha publicado guías similares para plaguicidas y pesticidas.146 Esto incluye el uso de datos existentes para read-across y la consideración de las propiedades fisicoquímicas de la sustancia de prueba.147148

Toxicidad sistémica por dosis repetidas

En los estudios de toxicidad por dosis repetidas, los animales son expuestos reiteradamente a sustancias durante un mes (subaguda), tres meses (subcrónica) o varios años (crónica) para medir los efectos de múltiples exposiciones a sustancias químicas, las cuales suelen administrarse a los animales mediante una sonda (gavage), a menos que se prevea que los humanos estarán más expuestos por otra vía. Como ocurre con otros parámetros, la evidencia muestra que los estudios regulatorios que usan animales para evaluar la toxicidad por dosis repetidas no cumplen adecuadamente su propósito y, por ello, existe una clara necesidad de desarrollar nuevos enfoques. Dos estudios publicados en 2020 evaluaron las fuentes de variabilidad en los valores usados para derivar niveles seguros de exposición a partir de pruebas de dosis repetidas en roedores y encontraron que aproximadamente un tercio de la variación total no podía explicarse a partir de diferencias en los protocolos, por ejemplo, la vía de administración.149150

La evaluación de la toxicidad por dosis repetidas es un requisito estándar en las evaluaciones de seguridad para los humanos. Aunque los enfoques read-across son aceptados con fines regulatorios, otros métodos sin animales aún no han logrado una aceptación completa. Para abordar esta brecha en el uso de métodos sin animales, diversos proyectos en el ámbito académico, industrial y regulatorio han propuesto conjuntos variados de ensayos in vitro e in silico basados en tecnologías “ómicas” y de alto contenido y rendimiento. Estas iniciativas se centran en desarrollar métodos de prueba sin animales para derivar puntos de partida in vitro, predecir concentraciones plasmáticas máximas o calcular tasas de exposición a la bioactividad.151152153154 Un estudio de caso de la OCDE sobre el uso de un IATA para la toxicidad sistémica demuestra la aplicación de estas metodologías avanzadas.155

Mientras continúan desarrollándose e implementándose sistemas de prueba in vitro en el ámbito regulatorio, el número de animales usados en pruebas de toxicidad por dosis repetidas bajo diversos marcos normativos puede reducirse inmediatamente mediante la extrapolación de puntos de partida de estudios subcrónicos a estudios crónicos.156 Una revisión de los puntos de partida (NOAELs o LOAELs) determinados a partir de estudios in vivo de aditivos alimentarios mostró que los valores crónicos pueden extrapolarse de manera confiable a partir de estudios subcrónicos, respaldando análisis previos de otros tipos de sustancias, incluidos productos químicos industriales y plaguicidas. La evaluación del riesgo y la derivación de valores de referencia basados en la salud pueden fortalecerse aún más con la aplicación precautoria de un factor adicional de incertidumbre de 2 para tener en cuenta cualquier valor atípico, lo cual recomiendan la EFSA y varios estudios recientes.157

Vía oral

NICEATM y el Comité Interinstitucional de Coordinación para la Validación de Métodos Alternativos (ICCVAM) llevaron a cabo un proyecto para desarrollar modelos predictivos de toxicidad sistémica oral aguda.158 El resultado fue la herramienta Collaborative Acute Toxicity Modelling Suite (CATMoS), que predice la toxicidad oral aguda y satisface diversos requisitos normativos.159 Esta herramienta generó 139 modelos predictivos con datos de aproximadamente 12.000 sustancias químicas y, tras ponderar el desempeño de cada uno de estos, se construyó un modelo combinado. CATMoS se implementa a través de la aplicación Open Structure-Activity/Property Relationship (OPERA), una herramienta QSAR de código abierto y acceso gratuito.160 Este modelo se optimiza y evalúa con frecuencia,161 y las actualizaciones están disponibles en los sitios web de NICEATM Integrated Chemical Environment (ICE) y la EPA.162 PETA Science Consortium International, PCRM y la EPA desarrollaron seminarios web sobre la herramienta CATMoS y la base de datos ICE (ThePSCI.eu/training-videos-webinars).

EURL ECVAM recomienda el ensayo in vitro de citotoxicidad 3T3 con absorción de rojo neutro (NRU), que puede emplearse en un enfoque WoE para respaldar la identificación de sustancias no clasificadas.163 Además, EURL ECVAM investigó cómo aumentar la confianza en el ensayo 3T3 NRU mediante el uso de QSAR y considerando información sobre el órgano diana y la falta de metabolismo en las células 3T3.164165166

En su Guía sobre los requisitos de información y la evaluación de la seguridad química, ECHA indica que se puede evitar un estudio in vivo de toxicidad oral aguda si el solicitante dispone de datos relevantes dentro de un enfoque WoE.167 En los casos en que la adaptación mediante WoE lleve a asumir una toxicidad oral aguda baja o nula (>2000 mg/kg de peso corporal/día), el solicitante puede evitar las pruebas en animales de acuerdo con los artículos 13(1) y 25(1) de REACH.168 En ThePSCI.eu/training-videos-webinars encontrarás más información sobre cómo reducir el número de animales usados para evaluar la toxicidad oral aguda en el marco de REACH.

Vía dérmica

La EPA y el NICEATM analizaron las contribuciones relativas de los datos de las pruebas de toxicidad oral y dérmica aguda a la clasificación y etiquetado de los riesgos asociados con los plaguicidas. Dado que se determinó que los datos dérmicos aportaban poco o ningún valor adicional en la toma de decisiones regulatorias, la EPA publicó una guía que permite a los solicitantes presentar una justificación científica sólida para demostrar que los resultados de la prueba oral aguda son protectores frente a posibles efectos dérmicos agudos.169170 Además, no se requieren estudios dérmicos para sustancias que no están clasificadas para la vía oral y que no se absorben por vía dérmica.171 Asimismo, de acuerdo con el Anexo VIII de REACH, las sustancias no clasificadas para la vía oral no requieren datos dérmicos.

Vía inhalatoria

Las pruebas por vía inhalatoria pueden evitarse con base en parámetros fisicoquímicos (p. ej., baja volatilidad) o si la exposición por inhalación es improbable (p. ej., en casos en los que la sustancia no se vuelva aerosol ni respirable bajo las condiciones de uso). Cuando se requiere realizar pruebas, se pueden usar métodos sin animales para cumplir con los requisitos de información. Por ejemplo, la EPA aceptó el uso de una prueba de biosolubilidad in chemico, que mostró que un polímero, inicialmente clasificado como una sustancia de baja solubilidad y  toxicidad, era soluble en un fluido pulmonar epitelial simulado y, por lo tanto, no representaba riesgo por sobrecarga pulmonar.172 Asimismo, en lugar de un estudio de inhalación de 90 días en ratas, la EPA aceptó datos de modelado in silico de dinámica de fluidos y pruebas in vitro con tejidos pulmonares humanos tridimensionales reconstruidos para cumplir con los requisitos de renovación de registro de un pesticida.173174 Además, se están llevando a cabo otras investigaciones prometedoras para desarrollar métodos sin animales para la toxicidad por inhalación.175

PETA Science Consortium International ha organizado numerosos seminarios web (ThePSCI.eu/inhalation-webinars) y talleres sobre varios enfoques que eventualmente podrían reemplazar las pruebas en animales para este parámetro,176177 ha financiado el desarrollo de métodos y ha implementado mecanismos de apoyo para proporcionar equipos y tejidos respiratorios in vitro para realizar estudios de toxicidad por inhalación.178 En ThePSCI.eu/our-work/inhalation encontrarás más información sobre las pruebas de toxicidad por inhalación.

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  171. OECD. Guidance document on considerations for waiving or bridging of mammalian acute toxicity tests. OECD Series on Testing and Assessment, No. 237. April 13, 2017. Accessed January 17, 2025. https://doi.org/10.1787/9789264274754-en ↩︎
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